-80℃及液氮凍存外周血干細胞的基礎及臨床研究 氣相液氮罐

摘要 目的：探討非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血干細胞(APRSC)與程控降溫液lu凍存APBSC對細胞生物學的影響，井對自體造血干細胞移植的效果進行比較，為非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC在臨床上的推廣應用提供依據。方法：回顧性分析非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC及群控降溫液氮凍存APBSC對ANC、MNC、CD34+細胞以及CFU-GM回收率的影響，并對72例接受自體造血干細胞移植的血液系統惡性腫瘤病人的造血重建的速度進行了比較。結果：兩種凍存方法的ANC、MNC、CD34+細胞及CFU。GM回收率的影響無顯著差異，移植后造血重建的速度亦無顯著差異。結論：非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC是一種簡便易行的凍存方法。在國內某些單位可以替代程控降溫液氰凍存APRSC進行干細胞移植。

關鍵詞 自體造血干細胞移植 造血干細胞(凍存) 惡性腫瘤

非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血千細胞(APBSC)因其簡便易行。在國內上E在不斷地推廣，我科自1988年開展程控降溫液氨凍存APBSC進行干細胞移植及非程控降溫-80℃冰箱凍存自體外周血干細胞移植以來，共完成了72例。現將兩種凍存自體外周血干細胞移植結果總結如下。但禹內尚缺乏對二者的系統比較研究。我們試圖通過系統比較二者的區別。觀察非程控降溫-80℃冰箱凍存APBSC進行干細胞移植的有效性和可行性。

病例和方法

1.1病例液氮涼存組36例，男性19例，女性L7例。平均年齡26。2(4—47)歲。急性髓細胞白血病(AWL)兒例，急性淋巴細胞白血病(ALL)12例。非霍奇金淋巴瘤(NHL)6例，骨髓增生異常綜合征(iWI)S)RAEBT 3例，霍奇金淋巴瘤(1-11))l倒，粒淋混合急性白血病2例，多發性骨髓瘤(刪)l例。-80℃冰箱凍存組36例，男23例。女13例，平均年齡25。4(5—50)歲。急性髓細胞白血稍(A虬)7倒，急性淋巴細胞白血稿(從L)13例。非霍奇金淋巴瘤(NltL)11例。骨髓增生異常綜臺征(MDS)RAEBT l例。霍奇金淋巴瘤(1iD)2例。粒淋混合急性自血病l例。乳腺癌l例，神經母細胞瘤l例。

1.2 APBSC動員[21 全部病例均采用化療+刺激因子進行動員。方法為強化化療后9。10大+WBC確已F降至zui低值(一般在2。0X10’，L以F)，并開始有回升的趨勢，同時PLT不低于20X109幾時，使用造血刺激園子，利罱為150p∥12b。皮F注射。至采集結求。動員天數，液氮凍存組，平均5犬(4—7犬)：一80℃冰箱凍存組，平均4。5天(3-6天)。

1.3 APBSC采集當w13c恢復至4.0—10。0X 10 9／L時開始采集，液氮凍存組均用Bxter公司的CS一3000型血細胞分離機進行分離采集；-80℃冰箱凍存組均用COBE公司的Spectra型血細胞分離機進行分離采集。通過股靜脈插管(12F般腔Arrow公司)或通過救臂外周靜脈建立外周通道。每次循環血量中位數為8000ml(5000—13000m1)。采集時分血流速平均50m1／分。兩組采集的有核細胞數(Nc)、單個核細胞數(M№)、CD。CFU。GM的數量見表。。臺盼藍拒染率均為100％。

I.4 APBSC凍存兩組采集的APBSC懸液，平均每次約60m1。加少許肝素。計算單個核細胞(眥)數，加入R蹦r1640保養液，按l：1比例與冷凍保護液均勻混合。-80℃冰箱凍存組使保護液終濃度為5％二甲基強砜(刪S0)，6％羥乙基淀粉(HES)，螂白蛋白(ALB)，llNC含量為2—5x 10 8／ml。將所得混合液裝于冷凍袋中。直接置于-80X]冰箱中凍存。液lu組保護液終濃度為5％1圳S0，經卜3℃／分程控降溫至-80℃后置-196℃液氮中保存。凍存大數，液氮凍存組，中付數22.5(13—50)天。-80℃冰箱凍存組，中位數23(15-44)天。

1.5預處理方案兩組病人的預處理方案相似，即AML、ALL、MDS及NHL均用CAT或CET.C：CTX 60mg／kg／d×2天，A：Ara—c卜39／d×l天.E：vPl6 300-1000 mg／d×l天，中位劑量600mg／d.TBI總量zui低6Gy，zui高8.5(毗分兩天，劑量率<5.0rad／min。預處理結束后24小時回輸APBSC。

l.6 APBSC的解凍：將凍存袋自-80℃冰箱中或液氮中取出后立即放入40℃水浴箱中訊速解凍，不過濾，經中心靜脈插管訊速回輸。

結果

2.1 凍存前后APBSC的細胞數及回收率見表1。

2.2移植后造血功能重建見表2~表3。

2.3生存期及復發率液氮凍存組無病生存期40個月，復發率30。8％(1l例)。-80℃凍存組無病生存期39個月，復發率28％(10例)。移植后隨訪液氮凍存組共死亡ll例。-80℃凍存組共死亡6例。

討論

APBSCT采集后不能立即回輸。需凍存至少l周時間，或更長時間。凍存的目的是停止細胞代謝保持細胞活力，液氮(-196℃)溫度低，酶活性被完全阻斷，但由于這種方法設備昂貴、程序復雜而難于普及。1985年SZill等口l＼”1報道用6％細胞外冷凍防護劑羥乙基淀粉(1iES)和5％二甲基亞砜(DMS0)作為PBSC的冷凍訪護劑，不經程控降溫直接在-80"C冰箱中保存的方法，兩種凍存方法的NC、MNC、CD34、CFU—GM的回收率相擬I¨l，移植后造血重建(自細胞及血小板的恢復)時間也無差異t“1，本研究從來自兩個組的凍存結果來看與其所報道結果一致。但由于。80℃冰箱的凍存方法開展時問短，尚缺乏大樣本病例對比研究。我們試圖通過大樣本病例的對比研究，以期能得到更為全面準確的數據，為今后普及。80℃冰箱凍存APBSC進行移植治療惡性腫瘤病人而提供更可靠的依據。研究結果顯示二者所凍存細胞的Nc、刖c、CD34+細胞、CFU-GM的回收率及移植后造血功能重建均無顯著差異。移植后隨訪液氮凍存組共死亡15例，一80℃凍存組共死亡12例，均為復發后死亡。液氮凍存組無病生存期及復發率與一80"C凍存組無病生存期及復發率相仿。

1962年Goodman等實驗證實鼠、狗、猿等哺乳動物和人的外周血循環中存在造血干細胞。但在正常生理條件下。數量極少，正常人和疾病穩定期患者外周血中CD34+細胞數量為0。1-0。2％，只有骨髓中CD34+細胞數量的1-10*／d41，不能滿足臨床移植的需要。

經化療藥物和戚造血刺激因子可從骨髓中動員出大量造血干細胞唧，目前常用的化療藥物有環磷酰胺(CY)、足葉乙甙(VPl6)、順鉑等可增加血液中CFU。GM產量的6,5—13。3倍。細胞生長因子如G-CSF、GM。CSF等可增加外周血中CFU。GM達4-8倍。而化療藥和細胞生長因子聯臺應用效果更佳№’”，且動員的CD34+細胞具有更高分化潛能。本研究中，AML及MDS多用HAE方案，ALL多用MOEP方案，粒淋混合AL多用MOEP或HAE方案，NHL、HD多用MOEP或單用大劑量CTX(4。0)作為動員化療方案。既能起動員作用，又能起鞏固治療作用。

干細胞采集時間和采集量是移植能否成功的重要環節。經動員化療后，患者平均第6_7天WBC降至雖低，給予G-CSF 300 u g／d后患者外周血MNC迅速回升。楊勃彥等曾分別測定給G-CSF后MNC和CD34+、1by。1+細胞的變化，經統計平均注射G.CSF后第6-8天外周血CD34+細胞峰值，為采集zui佳時間。個別患者MNC上升過快或過緩，則需測定CD34+細胞以協助決定干細胞采集時間。干細胞采集量個體差異較大，采集范圍MNC為(2.3—7.55)×105，kg，CD34+細胞為(2.22。9.56)×106／kg，平均6。34×106／kg，經凍存，回輸時活細胞百分率平均>65％。非程控降溫-80"C冰箱保存APBSC的方法可靠、簡便，為APBSET的推廣應用創造了便利條件。